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轉錄因子調控下遊基因的表達主要通過結合基因的啟動子區招募RNA聚合酶誘導轉錄從而實現,而其他一些非轉錄因子蛋白也可誘導基因的表達,這些蛋白則是通過調控目的基因區域的表觀遺傳學修飾實現其調控功能,那這種調控機製如何探究呢?近日,Plant Cell 發文ARGONAUTE2 Enhances Grain Length and Salt Tolerance by Activating BIG GRAIN3 to Modulate Cytokinin Distribution in Rice 闡述了水稻AGO2蛋白通過調控BG3基因的組蛋白修飾差異從而調控BG3基因的表達,進而增加籽粒長度和耐鹽性的相關機製。其中關於AGO2的ChIP-seq實驗由xrk向日葵app色板承擔,快來看看是研究是如何開展的吧。

研究背景

作物的高產和穩產一直是作物遺傳育種的重要目標,在人口日益增長的今天,鹽堿土地的利用也為作物增強提供了重要的途徑。AGO蛋白已經在擬南芥中證明可以調控生長發育,並且AGO蛋白也廣泛參與了一些表觀遺傳調控(DNA 甲基化、ncRNA等),那麽在水稻中AGO蛋白作用及其機製仍不清楚,該文章闡述了AGO2蛋白在提高水稻籽粒長度和耐鹽性的重要作用,並對其機製進行了解析。

研究思路

ChIP-seq.png

主要結果

1、過表達AGO2增加了種子的長度和產量且提高了植株抗逆能力

首先作者構建了AGO2的過表達材料,包括過表達AGO(A2OX)和過表達Flag-AGO2(A2FOX),隨著AGO2表達量的增強,兩個過表達材料都表現出顯著的粒長增加和粒重增加(Fig.1),說明AGO2可以提高籽粒長度和產量。通過對高鹽處理下的植株表型、存活率、MDA含量檢測,發現過表達材料的抗逆性皆優於野生型,通過外施ABA後對植株根、莖的長度觀測,過表達材料正向調控ABA響應(Fig.2)。

ChIP-seq.png

2、AGO2過表達促進了BG3表達,進一步促進了下遊基因的表達

作者對A2OX-4和野生型植物進行轉錄組DEGs分析,鑒定出1514個上調和584個下調的DEGs (Fig3 A) .並且前人報道與籽粒長度相關的基因BG3也存在於本次上調差異表達基因中,並且經過qPCR驗證(Fig.3B)。對BG3高表的突變體材料(bg3-D)和過表達植物(BG3OX)的籽粒進行觀測,發現兩者籽粒與A2OX的表型非常相似(Fig.3C)。且A2OX-4差異表達的4個基因在bg3-D材料中也存在著相同的表達模式。對A2OX-4 DEGs和bg3-D DEGs關聯分析發現,在bg3-D鑒定出的DEGs中,55.9%(301/538)在A2OX中也有差異表達,其中,99.3%(299/301)在同上調或下調,93.3%(279/301)在兩個材料中都上調(Fig.3E),說明AGO2過表達可能是通過促進BG3基因上調,從而進一步調控下遊基因。

ChIP.png

3  BG3對鹽脅迫和ABA處理有調節作用且參與了AGO2促進籽粒增長和耐鹽過程

鹽處理下,bg3-D 和BG3OX存活率較高,都表現出較強耐鹽性,且ABA處理下,地上部和根係生長的敏感性均顯著增加,而BG3敲除材料則無耐鹽性(Fig.4).隨後作者在A2OX材料中敲除BG3,敲除材料雖然仍然具有稍長的籽粒一定耐鹽性,但是相較於A2OX材料,粒長、株高、耐鹽性都顯著降低(Fig.5),這表明BG3至少部分參與了AGO2在促進粒長和耐鹽性方麵的作用。

ChIP-seq.png

AGO2通過表觀遺傳修飾激活BG3表達

鹽處理後AGO2和BG3基因表達降低(Fig.6A、B),且鹽處理下BG3基因表達降低同樣發生在A2OX材料中,因此作者推斷鹽處理對BG3表達的抑製可能部分獨立於AGO2。通過AGO2的ChIP-seq分析顯示,AGO2在BG3啟動子區顯著富集,在BG3基因編碼區小程度富集(Fig.6C)。之前的研究報答,AGO蛋白可能通過調控表觀遺傳修飾進而調控基因表達,因此作者對BG3的DNA甲基化和組蛋白甲基化進行了研究,發現DNA甲基化並未發生變化,而激活標記的H3K4me3在A2OX材料中升高(Fig.6D)而抑製性標記H3K27me3降低(Fig.6E ),該結果與擬南芥中AGO1機製類似,因此作者推測AGO2通過調節染色質修飾而起轉錄激活作用,BG3是其主要靶點。

ChIP-seq.png

5、鹽處理下細胞分裂素分布變化與AGO2高表後模式一致。

因為BG3是一個潛在的細胞分裂素轉運體,作者對AGO2高表後的細胞分裂素分布格局進行了探究(Fig.7)並對鹽處理下細胞分裂素的分布格局(Fig.8)進行了比較,發現兩者分布格局十分相似,表明細胞分裂素分布的改變是植物對鹽脅迫的主要反應,AGO2高表調控了細胞分裂素的分布。

ChIP.png

文章總結

作者首先從過表達AGO2材料入手,證明了其在增加籽粒長度和提高耐鹽性的作用,這種過表達或者突變體材料是xrktw向日葵下载闡述基因功能所必不可少的。隨後以轉錄組為切入點,利用前人的研究,對其中的BG3基因重點關注,並通過BG3的過表達材料證明了BG3的功能以及進一步說明了AGO2調控BG3從而發揮調控功能。因為ChIP結果顯示AGO2結合在基因啟動子和本體區,結合AGO2蛋白特性,作者猜測其通過表觀調控影響了BG3的表達,因此對BG3的DNA甲基化和組蛋白修飾進行了研究,發現AGO2主要是通過調控BG3基因區域的組蛋白修飾來影響基因的表達的。最後以調控細胞分裂素的分布格局的機製解析了AGO2提高植物耐鹽性的機理所在。

文章給予xrk向日葵app最大的啟示在於對前人研究的深度分析與借鑒,隻有站在巨人肩膀上xrk向日葵app色板才能看的更遠,因此對自己研究對象已有報道的全麵了解是十分必要的,這對xrk向日葵app結果的解讀以及後續實驗設計指明了方向,所以在埋頭鑽研的時候,也看看前人發現了什麽有意思的東西,說不定xrk向日葵app的結果也是個有意思的故事。


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