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那些年ChIP-seq遇到的一些坑——第一彈:預處理的漩渦

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那些年ChIP-seq遇到的一些坑——第一彈:預處理的漩渦

發布日期:2019-06-17 作者: 點擊:

       寫在前麵的話:ChIP實驗做了多年的xrk向日葵app色板,公眾號如此的單薄,xrk向日葵视频app下污的資深技術小姐姐實在看不下去了,決定來一係列直擊靈魂深處的幹貨分享,快點來圍觀!

       記住,有件事一定要做,文末告訴你哦!

       染色質免疫共沉澱測序技術(Chromatin immunoprecipitation Sequencing, ChIP- seq)將染色質免疫共沉澱與第二代測序相結合的一種技術。它能夠高效地在全基因組範圍內檢測與組蛋白、轉錄因子等互作的DNA區段,是研究體內轉錄因子和靶基因啟動子區域直接相互作用的方法,對於調控蛋白在基因組上的結合靶點篩選、差異化表觀遺傳變異的原理揭示提供了重要的解決思路。因此,在過去十年已經成為表觀遺傳信息研究的主要方法,並且一大波的CNS都展示了完美的結果。那是不是ChIP-seq實驗就點一下,So Easy呢?

       噢,NO! NO! NO! 小編總是接到很多客戶的疑問:為什麽我的染色質超聲不下去?為什麽我檢測不到染色質的大小?為什麽我做完IP後沒檢測到濃度?為什麽IP之後驗證不到目的基因?……辛辛苦苦做了整個實驗,回頭隻發現了滿地的坑……(尷尬),所謂一著不慎滿盤皆輸啊!


       沒做過的小夥伴們會說,染色質免疫共沉澱測序技術也就是涉及到“染色質”、“免疫共沉澱”、“測序”麽,聽起來好簡單噢。剛起步做,還未待一遍流程走完,隻覺自己懵懂懂如墮五裏霧中,想要獲得理想的結果其實沒有“辣麽簡單”。沒關係呢,小編也是從這個時期走過的,那麽今天就跟大家分享一下那些年ChIP-seq遇到的一些坑。


       Q1:我要做一次染色質免疫共沉澱需要多少的材料呢?


       A1:染色質的總產率直接影響著後期免疫沉澱的效果。到底要用多少的材料才能夠做一次IP實驗呢?在展開實驗之前,首先要明確自己實驗內容,要選擇的目的抗體有多少?需不需要陽性對照和陰性對照?要不要做重複?確定好了研究的內容之後,就可以進行樣本準備了。小編根據大量樣本的實驗總結了每類樣本的大致用量(包括了目的抗體,陽性和陰性對照),供各位小主參考:

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        Q2: 為什麽實驗中,染色質超聲打斷後還是片段較大?


        A2:提及片段化的影響因素首先會想到如下幾點,比如:細胞數量、超聲體積、超聲片段大小、超聲儀設置的功率和累計超聲時間等,或者利用酶解方法中,酶的用量,buffer的成分等原因。xrk向日葵app色板先看兩張圖:


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       圖1和圖2是同一份樣本,同樣的片段化條件,為什麽超聲後的結果卻迥然不同?從圖1可以看出,片段化之後的片段主要分布在100-2000bp;圖2中染色質分布均勻在100-500bp,效果更好,即使將圖1中的超聲時間和功率都增加一倍,結果還是片段化較差。

       以上實驗材料,除了交聯時間不一樣,其他所有條件都一樣卻出現了完全不同的實驗結果。圖1的交聯時間為20 min,圖2的交聯時間為10 min。

       結論:為了穩定DNA和蛋白的相互作用,通常都會對樣本進行交聯。在前期交聯樣本的時候就要將交聯時間控製到蕞佳,切勿交聯時間過長使得染色質超聲不下去,片段較大;也不能時間太短,使得染色質結合不緊密,丟失染色質上靶蛋白位點。

       建議:對於組蛋白或組蛋白修飾抗體:細胞及組織樣本中交聯樣品10 min,植物樣本通常真空交聯樣品15-20min;對於轉錄因子或輔因子,推薦交聯10-30 min;

       Q3:為什麽交聯時間及片段化條件是按照文獻提供方法做的,可是解交聯了之後卻找不到DNA的影子呢?

        A3:這種結果有多方麵原因,xrk向日葵app色板還是以實際案例來說,如下兩張膠圖:


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       圖3解交聯時間為3h,圖4解交聯時間為8小時,且加了蛋白酶K進行消化。說到這大家也應該能明白原因了。xrk向日葵视频app下污都知道染色質是由DNA+蛋白構成,在解交聯之時,解交聯時間過短,使得染色質上的DNA和蛋白沒有完全分開,DNA被蛋白包裹,而蛋白質分子量較大,所以在膠孔中沒有跑出來,而部分被解交聯下來的DNA就正常的在瓊脂糖膠中遷移,就形成了圖3,片段化後的泳道隱隱約約能看到彌散的DNA,不能具體的看出DNA分布情況。當xrktw向日葵下载把解交聯的時間延長,出現了圖4就可以完全看出DNA片段分布,主要在100-500bp,效果還是很好的。

       除此之外,xrk向日葵app色板做過一些解交聯方法的一些探究可供參考:


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       Q4:我做的一些非常規樣本,馬鈴薯的塊莖,玉米的種子,番茄的果實,動物的脂肪組織,真菌的菌絲,按照標準的Protocol進行怎麽做完預處理後就“涼涼”了?什麽也沒有?

      A4:目前較為成熟的ChIP實驗主要集中在以細胞為研究對象中,動物、植物及真菌等有著自己獨特的細胞學結構,特別是植物和真菌有細胞壁的構造,在裂解細胞釋放核的過程較為困難,普通的細胞及核裂解液可能很難發揮較好的作用。這類疑難樣本的處理,不建議參照已發表的方案而不進行優化。

      通常xrk向日葵app色板在接觸此類樣本的預處理時,獲得較為純淨的細胞是必要的,如多層膜過濾,密度梯度離心。並且在染色質釋放時要調整裂解液的配方,對於較容易處理的細胞或組織,采用較弱的表麵活性劑處理,如NP-40等;對於難處理的組織類型,可用較強的表麵活性劑,如SDS處理,並且可通過改變裂解配方中的表麵活性劑的配比及濃度進行裂解。話不多說,直接上圖給大家看下xrk向日葵视频app下污製服這些疑難雜症的結果:

5.png

        掌握了這些技巧,xrk向日葵app是不是可以在預處理環節避免入坑了呢?你遇見了哪些坑歡迎留言分享,有獎勵哦!

        預知富集路上可能遇到的坑,且聽下回分解…

        還記得一開始告訴你有件事一定要做麽?

        躲坑秘籍,轉發分享!




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關鍵詞:基因表達定量,基因表達調控,表觀組學技術服務

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