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看siRNA如何借甲基化東風漂亮翻身

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看siRNA如何借甲基化東風漂亮翻身

發布日期:2019-09-19 作者: 點擊:

DNA的甲基化是真核生物中保守的的表觀修飾,也是研究最早的表觀修飾。DNA甲基化主要發生在胞嘧啶上,根據其背景序列的差異,又可分為CGCHGCHH三種類型(H = ACT)。DNA甲基化的動態變化有多種甲基修飾酶等調控,在植物中,RNA指導的DNA甲基化(RdDM)途徑被證明參與了三種類型DNA甲基化的從頭建立,因此受到了廣泛的關注。RdDM途徑簡單講就是siRNA與一些功能蛋白共同發揮作用,在特定位點建立DNA甲基化,因此該過程主要包括了兩個步驟,第一步siRNA的合成,其中Pol IVRNA聚合酶IV)和DCLDICER-LIKES)發揮了重要作用,第二步,siRNA介導DNA甲基化建立,PolVAGO4 / 6ARGONAUTE 4/6)和DRMDOMAINS REARRANGED METHYLASEs)參與其中。

隨著研究的愈發深入,DNA甲基化已經被證明廣泛存在於基因表達調控、免疫反應、印記、基因組穩定性等諸多生命活動中。那麽如何研究某一個生命過程中的DNA甲基化的變化?201812月,Genome BiologyIF=14.028)上發表文章Downregulation of RdDM during strawberry fruit ripening,文章探究了在草莓成熟過程中的DNA甲基化變化以及RdDM如何參與其中的。


1、實驗材料

草莓成熟三個階段材料:Fa1(綠色階段)、Fa2(半紅階段)、Fa3(全紅階段),每組2個生物學重複


2、實驗結果展示

2.1 不同成熟階段果實DNA甲基化模式

選取不同成熟階段的草莓果實(圖1a),對其進行全基因組甲基化測序,轉化率>99.6%,未成熟果實甲基化水平為7.5% 該結果與葉片甲基化程度較為相似。CG, CHG, CHH甲基化分別為40%11%2%。對於基因和TE密度低、中、高區域的DNA甲基化水平進行了研究,結果表明基因密度越高,甲基化水平越低,而TE密度高的區域,甲基化水平較高(圖1b)。對成熟階段的兩個極端:完全未成熟階段Fa1、完全成熟階段Fa2,作者重點分析了甲基化情況,總的來說,成熟果實甲基化程度低於未成熟果實(圖1d),說明在成熟過程中伴隨著DNA甲基化降低。blob.png

2.2 DMRs探究進一步證實成熟過程中DNA甲基化水平降低

鑒於Fa1Fa3兩個階段重複性較好,作者針對兩個階段(Fa3 vs Fa1)進行差異甲基化區域(DMRs)的探究。鑒定出了466個超甲基化DMRs以及2300個低甲基化DMRs。從不同DMRs數目也可以推測成熟過程中伴隨著DNA的低甲基化。針對不同的類型,作者也進行了相應的探究。發現三種類型CGCHGCHH變化區域與總的甲基化趨勢一致(圖2a)。針對代表性DMRs區域,作者進行了可視化展示(圖2 b),並對不同類型DMRs區域C堿基的甲基化進行了探究,成熟階段DNA甲基化水平降低,與之前結果一致。

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2.3 DNA甲基化抑製劑驗證DNA甲基化參與果實成熟

為了驗證DNA甲基化的降低在果實成熟中的重要性,作者對未成熟果實外施DNA甲基化抑製劑5-azacytidine,從表型看,外施抑製劑的材料明顯早熟(圖3a),針對特定功能基因作者進行了甲基化敏感qPCR,結果顯示,成熟重要基因的甲基化水平降低(圖3b)。這些實驗證明DNA低甲基化在果實成熟中發揮了重要作用。隨後對DMRs分布進行了探究,低甲基化DMRs主要集中在基因的啟動子區,這結果說明成熟誘導的DNA低甲基化可能調控了基因的表達。

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2.4 RdDM途徑基因表達降低

根據之前研究,成熟過程中低甲基化是由於去甲基化酶的高表,因此作者探究了草莓去甲基化酶的表達情況,根據同源性分析(圖4a)以及表達分析(圖4b),發現在草莓中去甲基化酶表達隨著成熟過程降低。這與之前的研究不一致。隨後作者對RdDM途徑中的關鍵基因的表達進行了統計,發現RdDM途徑中的關鍵基因的表達呈現下降趨勢,該趨勢與DNA甲基化變化趨勢一致。據此說明,DNA甲基化的降低與DNA甲基轉移酶的降低具有一致性。

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2.5 成熟過程中siRNA降低導致了低甲基化DMRs

RdDM途徑中24nt siRNA發揮了重要作用。作者對Fa1Fa3兩個階段的材料全siRNA水平進行了分析,結果表明21nt24ntsiRNA豐富最高(圖5a)。對24ntsiRNA分布規律進行了探究,結果顯示在基因的啟動子區和3′調控區顯著富集(圖5 b)。對於成熟過程中的低甲基化DMRs與整個基因組上siRNA分布比較,siRNA明顯與低甲基化DMRs區域重疊。結果說明,siRNA的降低導致了甲基化水平的降低。

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2.6 DNA甲基化的改變調控了基因的表達從而調控了果實成熟

作者對Fa3Fa1的材料進行轉錄組測序2316個差異表達基因被鑒定(圖6a),將DNA甲基化與基因表達關聯分析,結果顯示高表基因啟動子區域甲基化水平降低(圖6 bc)通過對低甲基化的上調和下調基因進行了GO富集分析,分析結果表明,高表達的基因多為細胞分裂、ABA合成、香味揮發等與成熟相關的基因,而下調基因多為光合作用以及一些代謝物合成等在成熟過程中低表的基因(圖6d)。總之,DNA甲基化調控了許多成熟過程中重要基因的表達。

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總結:

本次研究,作者通過對不同成熟階段的材料,對其甲基化進行探究,並通過甲基化抑製劑驗證DNA甲基化的改變對成熟過程的調控作用。隨後對RdDM途徑中關鍵基因以及siRNA的表達進行探究,闡述DNA甲基化的改變機製。最後通過與轉錄組測序聯合分析,對成熟過程中的差異基因進行深度挖掘,並闡述了DNA甲基化通過調控成熟過程中關鍵基因從而完成了草莓果實成熟的調控。

本篇文章,除了為了草莓成熟調控機製進行了探究以外,也為xrk向日葵app探究不同的生物過程中DNA甲基化的作用提供了思路,通過對特定生物過程中的材料的甲基化進行探究,並對差異甲基化原因進行探究,同時結合生物過程中關鍵基因,對DNA甲基化調控特定生命過程提供新的機製。


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關鍵詞:WGBS,BS-seq,siRNA

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