您好!歡迎來到武漢xrktw向日葵下载生物科技有限公司的官方網站!

表觀組學技術服務

新聞分類

產品分類

聯係xrktw向日葵下载

武漢xrk向日葵app生物科技有限公司

電話:027-87606602(市場部)  

          027-62431231(行政部)

Q Q : 270105245   465436937   

         1511879086   812115916

傳真:027-87606602

郵箱:support@celebsonice.com

地址:武漢市東湖高新區高新大道888號高農生物園高農國際1棟  

網址:www.celebsonice.com


RIP-seq、MeRIP-seq係統闡述KIAA1429肝癌發生調控機理

您的當前位置: 首 頁 >> 新聞中心 >> 文獻解讀

RIP-seq、MeRIP-seq係統闡述KIAA1429肝癌發生調控機理

發布日期:2020-04-16 作者: 點擊:

RNA的化學修飾是表觀調控的一個重要內容,雖然報道RNA存在將近150種修飾,但是 N6-甲基腺苷(m6A)修飾是真核生物中RNA最豐富的修飾類型。

在哺乳動物細胞中,m6A修飾是由m6A writersm6A readersm6A erasers調控的可逆過程。其中m6A writers負責m6A修飾的建立,其中包括了 METTL3METTL14WTAP等。相反,ALKBH5FTO作為m6A erasers,去除m6A修飾。另外,m6A修飾發揮功能需要m6A readersm6A修飾進行識別,包含YTHDF1YTHDF2YTHDF3YTHDC1m6A reads調節修飾RNA的翻譯和穩定性。

越來越多的證據表明,m6A修飾對多種生物調控過程有著重要而全麵的影響,包括轉錄剪接、RNA穩定性、翻譯效率、胚胎幹細胞的維持、細胞命運的決定、T細胞的穩態。對於m6Awriter的挖掘以及作用機製研究一直是當前熱點所在。

201912月在Mol Cancer上發表文章KIAA1429 contributes to liver cancer progression through N6-methyladenosine-dependent post-transcriptional modification of GATA3,闡述了肝細胞癌發病中,m6A writer KIAA1429如何通過調控RNAm6A修飾從而發揮作用的。


01

一、研究背景



肝細胞癌(Hepatocellular carcinomaHCC)是原發性肝癌最常見的亞型,是全球致死率第三的癌症。肝癌術後複發轉移率高,預後差,且治療手段十分有限。由於肝癌發病機製的分子機製尚未完全闡明,闡明肝癌發生的關鍵因素將有助於理解肝癌的發病機理並為開發新的有效靶向治療方法提供依據。

許多研究已經證明了m6A修飾在人類癌症中的關鍵作用。例如,ALKBH5已經被證明通過去除FOXM1新生轉錄本甲基化、增強FOXM1的表達來維持膠質母細胞瘤幹細胞的致癌性。METTL3被認為是肝癌的致癌因子,它通過抑製SOCS的表達來促進肝癌的發生和轉移。據報道m6A writer KIAA1429基因敲除後m6A水平明顯降低,且比METTL3METTL14基因敲除後 m6A修飾水平降低更為明顯,因此KIAA1429在可能在甲基轉移酶中發揮更重要的作用。


02

二、研究思路


1.png



03

三、實驗結果



3.1 KIAA1429在肝癌組織中高表且與預後不良相關

為了研究KIAA1429在肝癌中的表達情況,作者首先查詢了癌基因組圖譜(TCGA)數據庫中50對肝癌樣本基因表達情況,結果顯示,KIAA1429在肝癌組織中的表達明顯高於癌旁正常組織。隨後, 通過對華西醫院70HCC組織qPCR分析,證實KIAA1429HCC組織中的表達與相鄰正常組織相比顯著上調(圖1 a)。此外,免疫組化(IHC)染色和western blot分析進一步證實KIAA1429HCC中上調,這與在mRNA水平上的觀察一致。將70例肝癌組織中KIAA1429的表達與臨床特征關聯分析,發現KIAA1429的高表達與腫瘤大小(P<0.0303)、血清AFPP<0.0157)、微血管侵犯(P<0.0168),TNM時期(P = 0.0220)和BCLC時期(P = 0.0051)有顯著相關性。Kaplan-Meier生存分析表明,KIAA1429表達的增加與生存時間段和無病生存率低期相關(圖1 bc)。總之,這些結果表明KIAA1429可能與肝癌的進展有關,可能是一個潛在的肝癌預後指標。


3.2 KIAA1429促進腫瘤生長和轉移

接下來,作者對7個人類肝癌細胞係中KIAA1429的表達進行檢測,其中SK-Hep1HCCLM3顯示出較高的KIAA1429表達。為了探討KIAA1429在細胞生長和轉移中的致癌作用,作者構建了KIAA1429基因敲除和沉默細胞係。其中KIAA1429基因敲除顯著抑製SK-Hep1HCCLM3的增殖、細胞周期和凋亡抵抗(圖.1d-g)。此外,沉默KIAA1429明顯降低了SK-Hep1HCCLM3細胞的侵襲和遷移能力(圖.1h-i)。

2.png

為進一步研究KIAA1429的體內致癌作用,將感染LV-shKIAA1429和感染LV-shCtrlSK-Hep1HCCLM3細胞接種於裸鼠皮下。與LV shCtrl組相比,LV-shKIAA1429組的腫瘤體積和重量均顯著減少(圖.2a-b),表明KIAA1429的表達降低有效抑製體內腫瘤生長。隨後作者評估了KIAA1429對癌症轉移的影響,將感染LV-shKIAA1429LV-shCtrl的細胞移植到裸鼠肝髒,建立肝移植模型,移植6周後,LV-shKIAA1429組肝轉移熒光信號強度明顯低於LV-shCtrl組(圖.2c-d)。HE染色顯示,在肝組織切片中,LV-shKIAA1429組的轉移灶數量顯著減少(圖.2e-f),揭示KIAA1429增強了肝癌細胞的肝內轉移能力。將熒光素酶標記的細胞注入裸鼠尾靜脈,建立肺轉移模型,與LV-shCtrl組相比,LV-shKIAA1429組小鼠的發光信號強度顯著降低(圖.2g-h),肺轉移結節的熒光信號強度(圖.2i-j)肺組織切片轉移灶顯著降低(圖2.kl)說明KIAA1429可以促進肝癌細胞的肺轉移潛能。總之,說明了KIAA1429促進腫瘤生長和轉移。

3.png


3.3 RNA-seqMeRIP-seqRIP-seq鑒定GATA3KIAA1429的下遊靶點

鑒於KIAA1429m6A writer,作者測定了KIAA1429對肝癌細胞中的m6A修飾調節作用。正如預期,在KIAA1429抑製的SK-Hep1HCCLM3細胞中,m6A水平較低(圖.3a-b),證明KIAA1429促進了肝癌細胞中的m6A修飾的建立。隨後,為了了解KIAA1429在基因表達方麵的調控作用,作者通過RNA-seq比較了對照細胞和KIAA1429敲除細胞之間基因表達。與對照相比,在KIAA1429敲除細胞中,共有448個差異表達基因,GO富集分析顯示,這些基因在特異性過程RNA分解代謝過程、RNA代謝過程、RNA轉運、RNA定位和翻譯、細胞周期、細胞死亡等過程中的顯著富集。值得注意的是, KEGG分析表明,各種癌症相關的信號通路受到KIAA1429敲除的影響,證實KIAA1429在促進肝癌進展中發揮作用。

為了闡明基因差異表達是否歸因於KIAA1429介導的m6A修飾,作者用MeRIP-seq比較了對照和KIAA1429敲除細胞間m6A整體分布。與先前報道的研究一致,“GGACmotif序列在MeRIP-seq中顯著富集(圖3c)。m6A peak主要定位於3UTR和接近終止密碼子的CDS區域(圖3e)。KIAA1429基因敲除細胞中鑒定到了1152個下調差異peak489個上調差異peak(圖3d)。由於KIAA1429促進m6A的修飾建立,KIAA1429敲除細胞中1152個下調差異peak受到重點關注。將差異下調peak與差異表達基因關聯分析,鑒定到 22個候選基因(圖3f),表明敲除KIAA1429可能降低這22個基因轉錄本的m6A水平,從而導致這些轉錄本的表達改變。為了進一步證實KIAA1429直接調控作用,采用KIAA1429RIP-seq實驗來確定KIAA1429結合的轉錄本。將RNA-seqRIP-seqMeRIP-seq的聯合分析,三者共關聯篩選出7個基因(TNFAIP2AKT2GATA3MSANTD3EIF4G1MLPHCEP250)(圖3f),說明KIAA1429可能與這7個轉錄本結合並直接調節它們的m6a水平,導致這些轉錄本的表達改變。其中,GATA結合蛋白3GATA3)在KIAA1429  RIP-seq中的含量最高,其表達在KIAA1429基因敲除後的變化最為顯著(圖.3g-h),暗示KIAA429介導的m6a修飾可能主要集中在GATA3轉錄本上。基於以上證據,作者推測GATA3可能是KIAA1429介導的m6A甲基化的直接下遊靶點。

GATA3已經被證明是一個強大的腫瘤抑製基因。因此,作者檢測了來自華西醫院70個肝癌樣本中GATA3的表達水平。結果顯示GATA3在肝癌組織中的表達明顯低於鄰近正常組織(圖3i),並且與KIAA1429的表達顯著相關(圖3j),這意味著KIAA1429GATA3表達具有明顯的調節關係。隨後,作者通過轉染siRNAs或感染慢病毒包裝的shRNA來檢測GATA3KIAA1429沉默後的RNA和蛋白表達。KIAA1429基因敲除導致GATA3RNA和蛋白質水平上都明顯升高(圖.3k-p),進一步證明KIAA1429GATA3的直接上遊調節因子。

4.png


3.4 GATA3  3UTR參與KIAA1429介導的m6A甲基化

對照組和KIAA1429敲除的MeRIP-seq顯示在GATA3 mRNA中發現4m6A峰,包括5UTR上的1個峰、CDS上的1個峰和3UTR上的2個下調差異peak(圖4a),並通過MeRIP qPCR進一步驗證(圖4b)。隨後,作者通過MeRIP-qPCR分析GATA3 pre-mRNAGATA3 mRNA,結果顯示KIAA1429缺失後兩者m6A水平都下降(圖4b)。此外,與成熟mRNA相比,GATA3 pre-mRNA m6A水平都較低(圖4),表明m6A修飾的GATA3pre-mRNA更容易被降解。因此,作者推斷KIAA1429促進了GATA3 3UTRm6A甲基化,然後顯著降低了GATA3pre-mRNA的表達。為了驗證GATA3  3UTR在其中的重要性,作者構建了含有3UTRCDS-3UTR)和CDSGATA3-CDS表達載體,隨後與siRNAs共轉染到SK-Hep1HCCLM3細胞中。數據表明,抑製KIAA1429導致了GATA3在轉染GATA3 CDS-3UTR載體後顯著增加表達,而轉染GATA3 CDS後並無該現象(圖4c),表明3UTR對於KIAA1429GATA3的調節作用是必不可少的。其次,作者為了評估了m6A修飾對GATA3 3UTR的影響,構建了含GATA3 3UTRpmirGLO-GATA3-WT熒光素酶報告體係,並用胞嘧啶(C)取代m6Amotif的腺苷(A)基序,建立了pmirGLO-GATA3-MUT熒光素酶報告係統。在KIAA1429基因敲除後,pmirGLO-GATA3-WT的熒光素酶活性顯著上升(圖4d)。相反,pmirGLO-GATA3-MUTKIAA1429沉默沒有反應(圖4d),這表明GATA3表達的調節是由KIAA1429介導的對GATA3 3UTRm6A修飾控製的。

1.png


3.5  KIAA1429抑製了HuRGATA3pre-mRNA的結合

由於m6A修飾的GATA3 pre-mRNA不穩定,作者研究了在m6A甲基化作用下,哪些分子在GATA3 pre-mRNA的降解中起關鍵作用。根據之前的報道,RNA結合蛋白HuRpre-mRNA成熟和mRNA穩定性中發揮作用,已被鑒定對無m6A修飾RNA具有穩定的結合能力,因此作者想要探究HuR是否與本實驗模型相關。作者首先進行了熒光素酶報告係統分析。抑製HuR後轉染pmirGLO-GATA3-WT但不轉染pmirGLO-GATA3-MUT的細胞中的熒光素酶活性顯著降低(圖4e),表明HuR不利於m6A修飾的GATA3UTR穩定。接下來,RIP分析證實了HuRGATA3pre-mRNA之間存在相互作用(圖.4f-g)。相反,在HuRRIP產物中沒有觀察到GATA3 mRNA的顯著高濃度。最後,作者檢測了轉染siRNAsHuR細胞中GATA3GATA3 pre mRNAKIAA1429的表達。GATA3及其pre-mRNAHuR基因敲除後顯著下降(圖4h)。作者的發現表明,HuR通過與3UTR結合增強GATA3pre-mRNA的穩定性,而KIAA1429抑製了HuRGATA3pre-mRNA的結合。


3.6 GATA3-AS作為引導lncRNA以靶向方式促進KIAA1429GATA3 pre-mRNAm6A修飾 

同一RNA轉錄本在不同的生理或病理條件下可能顯示不同的m6A水平,可能是由於某些順式或反式因子作用產生的。因此,作者推測可能有一些特定的因素促使KIAA1429對肝癌GATA3pre-mRNA的優先識別。此外,有研究報道,反義轉錄衍生的長非編碼rnalncRNAs)參與了通過順式調節(cis regulation)影響親本pre-mRNAs的可遺傳性選擇性剪接。因此,作者注意到位於10號染色體上的局部lncRNALOC107984204是從GATA3基因的反義鏈轉錄而來,並且有653個核苷酸與GATA3pre-mRNA互補,作者稱之為GATA3-AS。作者推測GATA3-ASGATA3 pre-mRNAm6A修飾有關

接下來,作者初步分析了來自華西醫院臨床樣本中GATA3pre-mRNAGATA3-AS的表達之間的相關性。結果表明,GATA3-ASGATA3mRNA有一定相關性。亞細胞定位表明GATA3-AS主要定位於細胞核(圖.5 GATA3前體mRNA的亞細胞定位一致。更重要的是,GATA3-AS的缺失導致GATA3pre-mRNA的表達顯著增強,且GATA3RNA和蛋白質水平上顯著升高(圖5d5d)。基於以上結果和GATA3-ASGATA3-pre mRNA的序列互補性,可以推斷GATA3-AS可能作為一種順式作用元件參與KIAA1429GATA3-premrna的靶向調控。為了驗證這一假設,作者啟動了RNA熒光原位雜交(FISH)和免疫熒光(IF)的聯合應用,進一步證實了GATA3-ASKIAA1429的核共定位。此後,RIPqPCR分析表明, GATA3-ASKIAA1429免疫沉澱中有富集(圖5e-f)。相反,作者使用以GATA3-AS為靶點的生物素標記寡核苷酸探針進行RNApull down,驗證了GATA3-ASKIAA1429之間的相互作用。然而,GATA3-AS顯示HuR-RIP中的無,且RNA pull down無法檢測到HuR,排除了HuRGATA3-AS結合的可能性。此後,進一步分析以確定GATA3-ASGATA3 pre-mRNA之間的直接相互作用(圖5h-i)。總的來說,作者的觀察表明GATA3-ASKIAA1429GATA3 pre-mRNA有特異性的相互作用。

為了進一步探討KIAA1429GATA3 pre-mRNA的特異性選擇是否需要GATA3-AS,作者用RIP比較了對照組和GATA3-AS敲除細胞中GATA3 pre-mRNA的富集情況,表明GATA3-AS顯著促進了KIAA1429GATA3pre-mRNA之間的相互作用(圖5j-k)。與之一致的是,MeRIP qPCR顯示抑製GATA3-AS顯著降低了GATA3pre-mRNAm6A水平(圖5l-m)。抑製GATA3-AS加強了HuRGATA3pre-mRNA的結合(5n-o)並增強pmirGLO-GATA3-WT而非pmirGLO-GATA3-MUT的熒光素酶活性(圖5p.)。最後,作者發現GATA3-AS發揮了pKIAA1429GATA3 CDS-3UTRGATA3 CDS單獨載體轉染的細胞相似的作用(圖5q)。綜上所述,作者的結果表明,GATA3-AS通過同時與KIAA1429GATA3 pre-mRNA相互作用,引導KIAA1429優先介導GATA3pre-mRNAm6A修飾。

2.png


3.7 GATA3介導KIAA1429GATA3-AS誘導的腫瘤生長和轉移

為了確定GATA3是否是KIAA1429GATA3-AS所促進的惡性細胞腫瘤的重要因素,作者評估抑製GATA3是否可以挽救KIAA1429GATA3-AS基因敲除對肝癌細胞發生的影響。作者在GATA3-ASKIAA1429抑製細胞內用siRNAs處理GATA3GATA3的缺失顯著逆轉了沉默GATA3-ASKIAA1429對體外細胞增殖、抗凋亡、侵襲和遷移的影響(圖.6a-f)。隨後,進行了進一步的活體挽救實驗。穩定的GATA3-ASKIAA1429抑製細胞被LV-shGATA3有效感染。盡管LV-shKIAA1429LV-shGATA3-AS皮下腫瘤的體積和重量顯示出顯著的減少,但這兩組的GATA3抑製恢複了腫瘤生長(圖6g-j)。此外,在肺轉移模型中,抑製GATA3恢複了小鼠體內發光信號強度(圖6k)、肺轉移結節熒光信號強度的降低以及由GATA3-ASKIAA1429抑製引起的肺轉移灶的減少(圖.7a-b)。同樣,GATA3基因敲除可恢複由GATA3-ASKIAA1429降低引起的肝內轉移潛能受損(圖7c-d)。綜上所述,GATA3介導KIAA1429GATA3-AS的致癌功能。

最後,作者評估了來自華西醫院的70HCC樣本的GATA3表達與臨床特征之間的關係,這說明GATA3的低表達與微血管侵犯顯著相關(P = 0.0168),TNM時期(P = 0.0220)和BCLC時期(P = 0.0220)。此外,GATA3表達降低與總體生存率和無病生存率差有相關性。總的來說,這些發現表明GATA3可以作為肝癌患者預後的一個重要生物標誌物。

3.png


04

總結



總的來說,作者針對m6A writer KIAA1429的作用機理進行了深度的挖掘與闡述。首先通過病例樣本間基因的高表與疾病病症之間相關先分析說明了其在肝癌中的重要作用。隨後通過構建敲除和沉默材料,進一步證明了其在肝癌發生與轉移中的重要作用。隨後做了大量工作,闡述了其作用機製。首先從其介導m6A修飾能力入手,通過敲除材料與病變材料之間的MeRIP-seq,尋找下調差異peak,並且結合RNA-seq數據挖掘到調控m6A修飾的基因,進一步利用RIP-seq數據,鑒定到了關鍵直接作用靶基因GATA3。隨後對KIAA1429如何調控GATA3表達進行了探究,確定了其通過m6A修飾的建立影響GATA3 pre-mRNA穩定性從而調控GATA3 表達的作用,並闡述了抑製RNA結合蛋白HuR結合GATA3 pre-mRNA的機理。隨後根據已有報道中lncRNA調控m6A靶向建立的機製,對LncRNA -GATA3 AS進行探究,發現GATA3 AS對於作為引導lncRNA以靶向方式促進KIAA1429GATA3 pre-mRNAm6A修飾。左後對GATA3作為關鍵性靶基因在癌症發生和轉移中的作用進行了進一步驗證,係統性闡述了KIAA1429對肝癌發生和轉移的重要作用。

文章工作量較大,且研究內容較為係統全麵,驗證之間層層緊扣,並且結合已有報道,對本疾病發生機製進行探究,很好的講述了KIAA1429作為關鍵蛋白調控癌症的故事。其中對於靶基因的鑒定部分,利用RIP-seqMeRIP-seqRNA-seq聯合分析鑒定靶基因的思路對xrk向日葵app研究m6A動態調控關鍵蛋白具有重要意義,且該思路也適用於研究RNA結合蛋白的研究。


產品1.png


本文網址:http://www.celebsonice.com/news/511.html

關鍵詞:

最近瀏覽:

聯係xrk向日葵app

企業名稱:武漢xrk向日葵app生物科技有限公司

電話:027-87606602(市場部)  027-62431231(行政部)

Q Q :  270105245   1511879086  

          465436937   812115916

傳真:027-87606602

郵箱:support@celebsonice.com

地址:武漢市東湖高新區高新大道888號高農生物

          園高農國際1棟  

網址:www.celebsonice.com


表觀組學技術服務

熱推產品  |  主營區域: 江蘇 天津 武漢 上海 北京 湖北
  • 在線客服
  • 聯係電話

    027-87606602

  • 在線留言
  • 官方微信
  • 在線谘詢
    歡迎給xrktw向日葵下载留言
    請在此輸入留言內容,xrktw向日葵下载會盡快與您聯係。
    姓名
    聯係人
    電話
    座機/手機號碼
    郵箱
    郵箱
    地址
    地址