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ATAC-seq、scRNA-seq、ChIP-seq探究非淋巴組織調節性T細胞前體的產生機製

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ATAC-seq、scRNA-seq、ChIP-seq探究非淋巴組織調節性T細胞前體的產生機製

發布日期:2020-05-11 作者:xrk向日葵app色板 點擊:

       Foxp3調節性T細胞(Treg)是抑製自身反應和過度炎症的關鍵免疫細胞。在免疫失調、多發性內分泌病、腸道病和X-連鎖綜合征(IPEX)和壞疽小鼠中發現的致命性多器官自身炎症破壞都是是由轉錄調節因子Foxp3的突變引起的。Treg細胞調節多種免疫細胞的功能,從而影響多種疾病,包括癌症、自身免疫、過敏和傳染病。近年來,越來越多的實驗證明Treg細胞在非淋巴組織的穩態和再生中發揮了重要功能。包括內髒脂肪組織(VAT)、肌肉組織、肺組織、皮膚組織、中樞神經係統(CNS)中都有相應研究。雙調蛋白(Areg)被認為有助於再生過程。

最近,組織來源的Treg細胞的DNA甲基化和轉錄數據表明,幾乎所有非淋巴組織中都存在Treg細胞群,可通過白細胞介素33(IL-33)受體(ST2)和殺傷細胞凝集素樣受體亞家族G1(Klrg1)的表達識別,並將細胞群命名為“tisTregST2”。 這種ST2陽性的組織Treg細胞群不僅容易表達Arge等組織再生因子,而且還表達Th2相關因子,包括高水平的Gata3、Maf和IL-10。ST2陽性Treg細胞的重要組織內穩態和再生功能已在不同的非淋巴組織中得到表征,包括VAT、CNS、肌肉和結腸。雖然從不同的組織中都有分離,但是來自VAT和皮膚的Treg細胞在其表觀遺傳重編程中顯示出高度的重疊,表明在組織限製性特異化之前有一個共同的發育途徑,但是其分子途徑仍不清楚。

2020年2月18日發表於Immunity上的文章Precursors for Nonlymphoid-Tissue Treg Cells Reside in Secondary Lymphoid Organs and Are Programmed by the Transcription Factor BATF利用ATAC-seq、scRNA-seqChIP-seq探究揭示非淋巴組織調節性T細胞前體的產生機製,並驗證了轉錄因子BATF在其中的作用機製。


ChIP

結果展示

1、ATAC-seq探究不同組織Treg細胞群組織特異性特征和開放性模式

對穩態下tisTregST2細胞在不同組織中所占比例進行了探究(圖1A),並通過ATAC-seq對不同組織來源的Treg細胞群進行了染色質開放性研究,並進行PCA聚類分析,發現tisTregST2群體與Tconv細胞、LN衍生記憶細胞和原始Treg細胞不一致。對多個樣本進行染色質開放性比較,發現了核心”tisTregST2細胞特異性ATAC-seq峰(圖1 E),通過對核心差異peak的motif分析,並鑒定到了bZIP、ETS、NF-κB、NRL和GATA等轉錄因子在其中發揮了重要功能。並且對組織特異性通路進行分析,說明不同組織tisTregST2顯示出顯著的“核心”組織特征以及組織特異性。


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2、脾髒Nfil3(GFP)陽性Treg細胞可能是向Klrg1+ST2+tisTregST2分化的前體細胞

根據之前的研究報道Nfil3在表觀遺傳調控中發揮了重要作用,並且核心”tisTregST2細胞特異性ATAC-seq峰中也鑒定到Nfil3核心結合序列(圖2 A、B),因此作者猜測Nfil3可能有助於非淋巴組織Treg細胞分化的發生。因此作者構建了Nfil3(GFP))報告小鼠係,根據Nfil3(GFP)和Klrg1的表達,作者將Treg細胞分為三個群體,並對從脾髒分離的三個Treg群體進行UMAP(圖2 F)和t-SN分析。每一分類子集的細胞都形成了相當均勻的群體,子集之間幾乎沒有重疊。所有亞群均表達Foxp3,但隻有Klrg1+Nfil3(GFP)+Treg細胞顯示Klrg1 mRNA表達(圖2 G)。在從Klrg1-Nfil3(GFP)Treg經Klrg1-Nfil3(GFP)+Treg向Klrg1+Nfil3(GFP)+細胞的轉化過程中,發現了幾個關鍵的激活和分化基因。總的來說,這個結果表明脾髒Nfil3(GFP)陽性Treg細胞可能是向Klrg1+ST2+tisTregST2分化的前體細胞。

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3、scRNA-seq 探究脾髒和其他不同組織中Treg細胞的發育軌跡

作者對脾髒、腹股溝LN、BM、血液、VAT、皮膚、肺和肝髒中分離出CD4+CD44+CD25+Foxp3(GFP)+記憶Treg細胞,並進行了scRNA-seq。結果發現來自肺、VAT和皮膚的組織分離的記憶Treg細胞與兩個脾髒來源的Nfil3(GFP)+ Treg記憶細胞亞群之間幾乎沒有重疊,隻有少數來自前體的細胞位於不同的組織中,這表明隻有極少量的Treg細胞存在多個組織中。

隨後作者對來自脾髒的三個亞群細胞、皮膚、結腸和VAT的tisTregST2進行TCR的α和β鏈進行單細胞測序和克隆相關性分析,根據單細胞軌跡和TCR分析,結果表明脾髒Klrg1-Nfil3(GFP)+細胞通過Klrg1+Nfil3(GFP)+Treg細胞順序分化為tisTregST2細胞。


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4、RNA速度分析揭示tisTregST2前體的繼承性轉移和發育動力學

作者在對scRNA-seq數據進行RNA速度分析時發現了從Klrg1-Nfil3(GFP)–經由Klrg1-Nfil3(GFP)+到Klrg1+Nfil3(GFP)+的順序分化(圖4A)。為了進一步驗證這一點,作者使用熒光激活細胞分類(FACS)-純化的Klrg1-Nfil3(GFP)和Klrg1-Nfil3(GFP)+Treg亞群注入去Treg同源(CD45.1)Foxp3DTR宿主小鼠(圖4B和S4A)進行過繼轉移實驗。根據RNA速度、轉移實驗和出生後的發育動力學研究,脾髒Klrg1-Nfil3(GFP)+通過Klrg1+Nfil3(GFP)+前體細胞分化為組織常駐的Klrg1+Nfil3(GFP)+tisTregST2細胞。


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5、ATAC-seq探究Nfil3(GFP)+tisTregST2前體細胞的基因調控模式

為了剖析定義tisTregST2前體的分子程序,作者從脾髒中分離出Klrg1-Nfil3(GFP)、Klrg1-Nfil3(GFP)和Klrg1+Nfil3(GFP)+Treg細胞,並進行ATAC-seq實驗。通過兩個樣本之間的成對比較,得到了11330個差異Peak,並對差異Peak進一步分析。作者發現脾髒Klrg1-Nfil3(GFP)+和Klrg1+Nfil3(GFP)+tisTregST2前體中tisTregST2細胞特異區域的染色質開放性逐步增加。


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6、BATF與Nfil3(GFP)+tisTregST2前體發育有關

作者利用ATAC-seq得到的Klrg1-Nfil3(GFP)-Treg和Klrg1-Nfil3(GFP)+或Klrg1+Nfil3(GFP)+Treg細胞之間差異染色質開放區域,並確定其中BATF是高度富集的轉錄因子(圖6A)。為此,作者對BATF motif區域內ATAC-seq的測序進行可視化觀察(圖6 B)。通過對已發表的CD4+和CD8+T細胞BATF ChIP seq數據重新分析,作者注意到BATF ChIP-seq結果與ATAC-seq峰高度重疊(圖6C),這表明BATF可能在tisTregST2前體發生起到了重要作用。作者證實了脾髒的Klrg1-Nfil3(GFP)+Treg和Klrg1+Nfil3(GFP)+Treg細胞中的Batf表達升高(圖6E)。通過scRNA-seq數據找到了眾多BATF相關基因。隨後通過構建BATF 缺失材料證明,BATF是一個關鍵的轉錄因子,它通過驅動分子前體程序來促進tisTregST2前體的發育,如果缺失,則會導致前體細胞分化不足,從而導致非淋巴組織中沒有成熟的tisTregST2細胞。



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       小結:

       本實驗借助scRNA-seq測序分析,揭示了非淋巴組織調節性T細胞前體的產生機製,並且結合ATAC-seq、ChIP-seq,尋找其中關鍵的轉錄因子BATF,並對其作用機製進行了挖掘。單細胞測序技術發展如火如荼的今天,該技術已經廣泛應用於細胞分化、疾病發生等重要的生命過程,在此基因上,借助其他技術手段,對其中機理進一步探究也必定是今後研究發展的主要方向。另外,除了scRNA-seq之外,scATAC-seq也是當今熱門的研究手段,本文中,是否可以利用scATAC-seq進一步對研究結果進行驗證並挖掘更多有用信息呢?這也許是作者給xrk向日葵app色板留下的一個思考方向。

       IP類產品:ChIP-seq,DAP-seq,CLIP-seqRIP-seq,DRIP-seq,6mA-IPseq,MeRIP-seq,IP,Co-IP

       測序產品:WGBS,ATAC-seq,WGS,RAD/GBS,smallRNA,LncRNA,轉錄組,精準轉錄組,全轉錄組,降解組

       分子產品:EMSA,Y1H,Y2H,分子標記,熒光定量,載體構建

       新星產品:ScWGBS,ScATAC,ScRNA-seq,CUT&RUN,CUT&Tag

       其他產品:代謝組,修飾酶組


本文網址:http://www.celebsonice.com/news/521.html

關鍵詞:ChIP,ATAC,單細胞

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