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【一區11.147分】愛基ChIP-seq又發文章了-原核生物同樣要你好看

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【一區11.147分】愛基ChIP-seq又發文章了-原核生物同樣要你好看

發布日期:2020-05-26 作者:xrk向日葵视频app下污 點擊:

都說原核生物ChIP不好做,一方麵原核生物並沒有真正意義的染色體結構,因此對於ChIP而言,很難保證染色質(其實是蛋白和DNA複合物)的質量,另外ChIP體係對於原核生物也需要調整,但是不同原核生物調整策略也不盡相同,所以對於原核生物而言,需要一個對ChIP有著豐富經驗的實驗老手才能拿到一個好的ChIP結果。


        武漢xrk向日葵app色板作為一家專業提供表觀遺傳學技術服務的公司,ChIP一直是xrk向日葵app強項所在。原核生物的ChIP,也是經驗豐富。近期在銅綠假單胞菌研究中,南開大學醫藥化學生物學國家重點實驗室吳衛輝課題組在Nucleic Acids Res(IF=11.147)中發文PvrA Is a Novel Regulator That Contributes to Pseudomonas Aeruginosa Pathogenesis by Controlling Bacterial Utilization of Long Chain Fatty Acids探究PvrA在細菌侵染過程中的相關機製。

微生物ChIP 

其中關於PvrA的ChIP-seq實驗與分析,由xrk向日葵app色板提供技術服務。一起來看一下作者是如何開展相關研究的。

 

1、研究背景

銅綠假單胞菌(P.Aeruginosa)原稱綠膿杆菌。在自然界分布廣泛,為土壤中存在的最常見的細菌之一,同時它是一種致病菌,可以引發人類急性感染。對於致病性細菌而言,獲得和有效利用宿主營養物質至關重要。在這個過程中,細菌的調控蛋白在其中發揮了重要作用。探究銅綠假單胞菌中調控蛋白挖掘與機製解析具有重要的作用。

2、實驗設計

微生物ChIP

3、實驗結果

3.1 感染過程中銅綠假單胞菌轉錄組分析

        作者利用感染6小時後小鼠收集細菌細胞進行轉錄組測序,並與空白對照進行了比較,發現19個基因顯著上調差異表達, 並且經過了RT-PCR驗證。其中前人已經報道的、在細胞毒性中發揮重要作用的關鍵基因exsA, pchR, typA 和 fis也存在於本次的19個DEGs中。為了研究這種差異表達模式的保守性,作者利用其他菌株進行同樣的實驗,結果與之一致。

3.2 差異表達基因在致病作用驗證

為了進一步說明19個差異表達基因的作用,作者利用突變體菌株庫以及自己構建突變體菌株的方式,獲得了19個基因的突變體菌株。利用突變體菌株進行侵染實驗,結果發現,PA295突變體的細菌定植能力大幅下降,另外提高了小鼠的存活率。並且這種改變可以由回補PA2957恢複。作者將該基因命名為pvrA,並且對其序列研究,發現其在假單胞杆菌中具有保守性,屬於TetR家族轉錄調控因子。

微生物ChIP

3.3 pvrA結合位點確定

為了探究pvrA結合特性,作者構建了Flag標簽轉基因材料,利用ChIP-seq(武漢xrk向日葵app色板提供了該項技術服務)手段,發現其結合了宿主卵磷脂利用關鍵基因plcH、fadD1、fadD6和PA0508以及glcB、maeB和aprA等一些三羧酸循環和細菌毒性相關基因。並利用EMSA證實了這些基因啟動子區域的結合(Fig.2)。利用ChIP-seq數據,MEME對其motif分析,發現其保守性結合於5′-CGGTCA-3′序列(Fig.3 A),將fadD1啟動子序列刪除該序列後,EMSA結果顯示其結合能力也喪失(Fig.3 B),進一步證明其結合序列的保守性。

為了進一步說明pvrA的調控作用,作者構建了pvrA的突變體菌株,利用野生型和突變體菌株感染小鼠後收集菌株進行基因表達量分析,pvrA, plcH, fadD1, fadD6, PA0508, aprA, glcB 和maeB基因在野生型中都上調,而在突變體中表達抑製,證實了pvrA對該基因的調控作用(Fig.4)。

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3.4pvrA在細菌利用卵磷脂以及棕櫚酸發揮了重要作用

因為pvrA結合基因參與了卵磷脂和棕櫚酸的利用,為了證實pvrA的作用,作者利用野生型和突變體菌株分別在葡萄糖培養基、卵磷脂唯一碳源培養基、棕櫚酸唯一碳源培養基上進行培養,並對其中關注基因進行了表達量分析。發現突變體菌株在卵磷脂唯一碳源培養基、棕櫚酸唯一碳源培養基上生長都受到抑製,並且重要基因的表達都受到了抑製。總的來說,作者通過突變體材料驗證了結合靶基因調控基因表達的機製。

3.5棕櫚酰輔酶A是PvrA的配體

根據前人的報告,脂肪酰輔酶A作為配體在脂肪酸利用過程中發揮了重要作用,作者猜測櫚酰輔酶A可能作為PvrA的配體發揮作用。作者利用分子對接分析(Molecular docking,研究配體-蛋白組對接的分析手段)預測兩者可能存在相互作用,並且R136可能是互作關鍵位點。利用ITC分析(等溫滴定量熱法,以熱力學探究分子互作),顯示PvrA和棕櫚酰輔酶A之間存在積極的相互作用,但與棕櫚酸之間沒有相互作用(Fig.7)。用丙氨酸替換R136(R136 A突變)降低了PvrA和棕櫚酰輔酶A之間的相互作用。利用增加棕櫚酰輔酶A後EMSA實驗,說明棕櫚酰輔酶A增加了pvrA的結合DNA能力,這種增加會因為R136A突變而喪失(Fig.8)。SPR分析(表麵等離子體共振)pvrA與fadD1啟動子結合,結果與EMSA一致(Fig .9)。此外,利用R136A回補ΔpvrA突變體,發現其既不能恢複fadD1、fadD6、PA0508和plcH表達,也不能恢複細菌毒性(Fig.10)。這些結果表明,棕櫚酰輔酶A可能是PvrA的配體,激活plcH和脂肪酸利用基因。

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3.6 PvrA可能通過協同調節多基因參與細菌毒性

為了驗證plcH, fadD1, fadD6 和 PA0508在細菌毒性中的作用,作者構建了野生型以及各個基因的單突菌株、雙突菌株、三突以及四突菌株,結果表明單突、雙突、三突菌株的菌落總數與野生型並無差異,四突明顯降低,預示著PvrA可能通過協同調節多基因參與細菌毒性。

微生物ChIP

 

文章總結:

文章整體思路清晰,從轉錄組入手,鑒定顯著性差異表達的基因,並對這些基因的功能進一步驗證。對於差異表達的調控因子PvrA重點關注,首先通過ChIP-seq探究結合位點以及保守結合序列,並通過突變PvrA後靶基因的表達差異證明結合作用的真實性,隨後對於下遊靶基因進行突變等試驗證明靶基因的功能。並且對於目的蛋白發揮作用的互作配體棕櫚酰輔酶A也進行了探究,通過分子對接分析、ITC分析、EMSA證明了棕櫚酰輔酶A在PvrA發揮功能時的重要作用。最後通過設計不同突變體材料,進一步解析了PvrA協同調控多基因影響細菌毒性的機製。

文章亮點頗多,首先材料的豐富性也是讓人羨慕不已,突變體材料對於驗證基因功能是十分有力的武器,作者對19個上調基因全部獲得突變體材料,靶基因的突變體材料,並且後期構建的單突、雙突、三突、四突材料等更有說服力的證明了基因的功能和調控機製。另外對於目的調控蛋白的研究也是十分完整,對其結合序列、互作蛋白都有相應研究,值得借鑒。通過ChIP-seq鑒定靶基因和保守結合序列,隨後EMSA驗證結合,並通過靶基因的突變體材料和目的蛋白突變體材料,證明調控作用的真實性。對於蛋白發揮功能的互作蛋白研究也是xrk向日葵app一直推薦要做的研究,作者也對此進行了探究,並且對配體結合作用以及具體發揮功能的關鍵核心蛋白功能域做了探究。最後通過前麵的結果,構建了目的蛋白的調控網絡,文章思路流暢且清晰,結果多重驗證保證了結果的真實性,該研究思路適用於研究對目的蛋白調控機製的研究。


IP類產品:ChIP-seq,DAP-seq,CLIP-seqRIP-seq,DRIP-seq,6mA-IPseq,MeRIP-seq,IP,Co-IP

測序產品:WGBS,ATAC-seq,WGS,RAD/GBS,smallRNA,LncRNA,轉錄組,精準轉錄組,全轉錄組,降解組

分子產品:EMSA,Y1H,Y2H,分子標記,熒光定量,載體構建

新星產品:ScWGBS,ScATAC,ScRNA-seq,CUT&RUN,CUT&Tag

其他產品:代謝組,修飾酶組



本文網址:http://www.celebsonice.com/news/527.html

關鍵詞:轉錄因子,ChIP,xrk向日葵视频app下污

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