【一區4.611分】褐飛虱-xrk向日葵appChIP-seq又發文章

真核生物轉錄起始過程十分複雜，往往需要多種蛋白因子的協助，轉錄因子與RNA聚合酶Ⅱ形成轉錄起始複合體，共同參與轉錄起始的過程，從而完成對下遊基因的調控作用，那這種調控機製如何去探究的呢？近日Science China-Life Sciences發文FoxO directly regulates the expression of TOR/S6K and vitellogenin to modulate the fecundity of the brown planthopper，闡述了FoxO通過與NlS6K，NlTOR啟動子和NlVg外顯子結合影響Vg網絡中的基因表達來調節昆蟲繁殖力，其中FoxO的ChIP-seq實驗由xrk向日葵app色板承擔。

作為保守的轉錄因子，FoxO在抗逆，壽命，生長和繁殖多種生理過程中起著至關重要的作用。人們之前關於FoxO的研究主要集中在人類，小鼠，果蠅和秀麗隱杆線蟲上，而關於農業害蟲的報道很少，特別是關於FoxO如何調節昆蟲繁殖力知之甚少。在亞洲，褐飛虱（BPH）是水稻生產中最嚴重的害蟲之一，高繁殖力是褐飛虱爆發的主要原因。

（1）ChIP-seq鑒定NlFoxO結合位點

為了深入了解NlFoxO如何調節BPH中的繁殖力，作者利用BPH成年和若蟲進行了ChIP-seq，並鑒定了11069個NlFoxO結合的特異peak，這些peak關聯到BPH轉錄組中的2760個基因。基於轉錄組和BPH參考基因組之間的注釋文件，將距5'末端上遊轉錄起始位點3 kb的序列定義為啟動子序列。這些結合區域中，基因間區占61.06％，啟動子占6.80％，內含子占22.56％，基因的CDS占9.18％。在5'或3' UTR檢測到不到0.50％的結合位點。然後作者使用MEME軟件發現四個相似的motif都包含TGTTT core序列。已知FoxO調控的靶基因在不同物種之間差異很大，因此作者比較了BPH，黑腹果蠅和尖音庫蚊的靶基因。結果顯示有18.06％的基因（317）在BPH和果蠅中都是共有的，而在BPH和尖音庫蚊之間沒有發現重疊的基因。果蠅和尖音庫蚊之間隻有3個保守FoxO靶基因。                                         

圖1 FoxO ChIP-seq結果

（2）NlFoxO直接與S6K，TOR和Vg結合並影響其表達

作者為了驗證N1FoxO是否特異性結合候選靶基因區域，使用ChIP定量PCR（ChIP-qPCR）進行驗證。ChIP-qPCR結果證實了N1FoxO特異性結合核糖體蛋白S6激酶（S6K），絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶mTOR（TOR），卵黃蛋白原（Vg）這些基因啟動子區域。經過進一步分析發現N1FoxO可能與NlS6K和NlTOR的啟動子以及NlVg的第三個外顯子結合，另外，作者進行了qRT-PCR來驗證NlFoxO對成年雌性這些基因表達的影響。與對照組相比，NlS6K的mRNA水平在72 h內下調，NlTOR的mRNA水平在24 h和48 h下調。相反，NlVg的mRNA水平在所有三個時間點均顯著增加。這些結果表明，N1FoxO的結合可能促進N1S6K和N1TOR的表達，並抑製N1Vg的表達。進一步作者利用螢光素酶活性來檢測啟動子活性。結果表明NlFoxO直接結合增強S6K和TOR的啟動子活性。

圖2 FoxO ChIP-qpcr驗證

（3）RNAi探究NlFoxO對BPH生殖力的影響

作者以短翅類BPH作為材料，將dsFoxO注射到一天大的BPH短翅類成年雌性，結果發現NlFoxO的mRNA和蛋白水平顯著降低。然後作者進一步評估NlfoxO對BPH繁殖力的影響。結果顯示NlVgR的mRNA水平在72小時內顯著下降。盡管NlVg  mRNA水平在72小時內上調，但注射dsFoxO後72 h N1Vg的蛋白質水平卻顯著降低。最後，作者在注射dsFoxO後去測量BPH雌性所產卵的數量。與對照（dsGFP）相比，每對產卵的平均數量從628.70顯著下降到305.50，下降了51.40％（圖4E），平均孵化率從82.54％顯著下降到75.33％。這些結果證實了N1FoxO對於維持BPH中的正常繁殖是必不可少的。

圖3 qRT-PCR驗證NlFoxO對BPH生殖力的影響

總的來說，本研究表明FoxO通過與NlS6K，NlTOR啟動子和NlVg外顯子結合影響Vg網絡中的基因表達從而調節昆蟲繁殖力。